.png)
Spektrofotometri
Pendahuluan
Spektrofotometri merupakan bagian dari sperktroskopi, yaitu ilmu yang mempelajari interaksi radiasi dengan materi. Spektrofotmetri sendiri adalah istilah yang lebih terbatas, merupakan pengukuran kuantitatif dari intensitas radiasi elektromagnetik pada satu atau lebih panjang gelombang dengan suatu transduser (detektor) (Harvey 2000). Metode spektrofotometri menghasilkan sebuah tampilan hubungan antara intensitas radiasi yang teremisikan, terabsorpsi, atau terhamburkan oleh sampel dan kuantitas yang berhubungan dengan energi foton (E), seperti konsentrasi dan panjang gelombang (λ), yang disebut dengan spektrum (Wang 2001).
Pada percobaan ini, metode spektrofotometri diterapkan pada penentuan konsentrasi asam amino lisin pada kentang. Panjang gelombang maksimum (λ max) untuk percobaan ini telah ditentukan, yaitu 625 nm, dimana pada panjang gelombang ini respon absorbans berada dalam kondisi maksimum sehingga akan memiliki sensitivitas yang baik dan limit deteksi yang rendah. Hal ini juga dapat mereduksi kesalahan dalam pengukuran (Rouessac 2007).
Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan mengetahui spektrum serapan suatu zat dan menentukan kandungan asam amino bebas pada kentang dengan cara spektrofotometri.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang dipakai adalah spektrofotometer, kuvet, labu takar 25 ml dan 50 ml, tabung reaksi, penangas air, sentrifusa, spektronik-20, gelas piala, dan buret 50 ml. Bahan-bahan yang digunakan adalah salah satu larutan standar pada penentuan kadar asam amino bebas, kentang, piridin 10%, ninhidrin 2%, asam amino lisin (20-50 ppm), dan kapas.
Prosedur Percobaan
· Pembuatan larutan standar dan blanko
Larutan standar disiapkan dengan menggunakan analat asam amino lisin, dengan konsentrasi 20 ppm sampai 50 ppm. (dibuat dengan menggunakan labu takar 25 atau 50 ml dari larutan stok). 5 ml larutan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 0,5 ml piridin 10% dan 0,5 ml ninhidrin 2%. Tabung ditutup dengan kapas kemudian ditempatkan dalam penangas air mendidih selama 20 menit atau sampai terjadi perubahan warna. Setelah dingin diencerkan menjadi 50 ml dalam labu takar dan ditera.Larutan blanko disiapkan dengan mengganti analat menggunakan air suling.
· Pembuatan larutan contoh
Disuspensikan 0,5 gram kentang dalam 20 ml air kemudian disentrifuse, supernatan ditampung dalam labu takar 50 ml. Proses tersebut diulangi, kemudian tepatkan volume supernatan sampai tanda tera dengan air suling. Ektrak asam amino 5 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambah 0,5 ml piridin 10% dan 0,5 ml ninhidrin 2%. Tabung ditutp dengan kapas kemudian ditempatkan dalam penangas air mendidih selama 20 menit atau sampai terjadi perubahan warna. Setelah dingin diencerkan menjadi 50 nl dalam labu takar.
· Analisis menggunakan spektrofotometer
Larutan standar, blanko, dan larutan contoh yang telah dibuat dianalisis menggunakan spektrofotometer. Digunakan panjang gelombang maksimum 625 nm (penentuan panjang gelombang maksimum ini tidak ditentukan dalam percobaan kali ini).
Data Hasil Pengamatan
· Analisis Larutan Standar
Tabel hasil pengamatan larutan standar
Konsentrasi
|
Transmitan
|
Absorbansi
|
20 ppm
|
78,6%
|
0,1046
|
30 ppm
|
68,6%
|
0,1637
|
40 ppm
|
54,2%
|
0,2660
|
50 ppm
|
49,4%
|
0,3063
|
Rata-rata
|
0,2101
| |
St. Deviasi
|
0,0925
|
Panjang gelombang = 625 nm
Gambar hasil pengamatan larutan standar
 | |||||||
 |  |  | |||||
20 ppm 30 ppm 40 ppm 50 ppm
· Analisis Larutan Blangko
Gambar hasil pengamatan larutan blangko
· Analisis Larutan Sampel
Tabel hasil pengamatan larutan sampel
Ulangan
|
Massa Sampel (gram)
|
Transmitan
|
Absorbansi
|
Konsentrasi
| |
ppm
|
% b/b
| ||||
1
|
0,5009
|
60,2%
|
0,2204
|
2,6771
|
0,0026
|
2
|
0,5033
|
51,6%
|
0,2873
|
3,6329
|
0,0036
|
3
|
0,5090
|
39,6%
|
0,4023
|
5,2757
|
0,0052
|
4
|
0,5150
|
38,2%
|
0,4179
|
5,4986
|
0,0054
|
Rata-rata
|
0,0042
| ||||
St. Deviasi
|
0,0013
| ||||
Panjang gelombang = 625 nm
Contoh Perhitungan Konsentrasi Sampel (menggunakan data ulangan ke-2):
Absorbansi= 0,2873= y
Didapatkan persamaan kurva standar y = 0,007x – 0,037 dengan R2 = 0,975
Untuk y= 0,2873 maka
0,2873 = 0,007x - 0,037
0,2873 – 0,037 = 0,007x
x = 35,7571 ppm (konsentrasi sampel dalam ppm)
Konsentrasi (ppm) = berat (mg) zat terlarut per berat (kg) pelarut
Maka berat (kg) pelarut = 
= 
= 14,0755 kg
= 14,0755 kg
= 14075,5 gram
Berat Larutan = Berat sampel + Berat Pelarut
= 0,5033 gram + 14075,5 gram = 14076,0033 gram
Konsentrasi sampel (% b/b) = 
= 
= 0,0036%
Rata-rata = 
= 
= 0,0042%
= 0,0042%
Sd = 
=
= 0,0013
Ketelitian = 
= 
Pembahasan
Aplikasi spektrofotometri berguna dalam penentuan konsentrasi suatu kandungan zat. Percobaan ini menggunakan metode spektrofotometri untuk menentukan kandungan asam amino lisin pada kentang. Hal yang pertama kali harus dilakukan adalah menentukan spektrum absorpsi lisin sehingga puncak spektrum gelombang tersebut (panjang gelombang maksimum) dapat diketahui. Namun dalam percobaan ini tidak dilakukan karena keterbatasan waktu. Panjang gelombang maksimum yang dipakai merupakan data sekunder, yaitu 625 nm.
Setelah panjang gelombang maksimum diketahui, maka dilakukan pengukuran absorbansi dari larutan standar lisin dengan konsentrasi 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, dan 50 ppm. Dari percobaan ini dihasilkan kurva standar dengan persamaan y = 0,007x - 0,037 dengan R2 = 0,975. Konsentrasi dalam kurva standar berupa ppm bukan % b/b karena tidak diketahui nilai dari berat pelarut. Semakin tinggi konsentrasi lisin, nilai transmitan akan semakin rendah dan nilai absorbansi akan semakin tinggi. Hal ini disebabkan oleh jumlah partikel zat terlarut (lisin) meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi sehingga berkas sinar yang diserap akan semakin tinggi (absorbansi tinggi) dan sinar yang diteruskan akan semakin rendah (transmitan rendah). Percobaan ini tidak menggunakan larutan standar protein seperti Bovin Serum Albumin (BSA) karena hanya dilakukan pengukuran absorbansi oleh satu jenis asam amino spesifik, bukan oleh protein yang merupakan polimer dari asam amino.
Perlakuan yang sama juga dilakukan pada air suling yang telah ditambahkan 0,5 ml piridin 10% dan 0,5 ml nihidrin 2%. Fungsi dari larutan ini adalah sebagai blangko. Blangko adalah larutan yang mendapatkan perlakuan yang sama dengan sampel dan standar namun tidak mengandung analat. Tujuan pengukuran absorbansi blangko adalah mengetahui besarnya serapan oleh zat bukan analat. Biasanya, absorbansi blangko dibuat nol (Wang 2001).
Berlanjut pada sampel berupa kentang, dilakukan pengukuran absorbansi dari larutan sampel kentang. Ninhidrin digunakan pada kentang untuk membentuk kompleks berwarna ungu jika bereaksi dengan asam amino. Dari absorbansi yang didapatkan, dicari konsentrasi (ppm) dari larutan sampel tersebut menggunakan persamaan kurva standar. Kemudian dari konsentrasi (ppm) dicari bobot pelarutnya dalam kg. Setelah dikonversi menjadi satuan gram, dicari bobot total larutan dengan penambahan bobot pelarut dengan bobot zat terlarut (bobot sampel). Konsentrasi (% b/b) kemudian didapat dengan membagi bobot zat terlarut (bobot sampel) dengan bobot total larutan. Konsentrasi (% b/b) lisin pada kentang dari percobaan adalah (0,0042 ± 0,0013)% (b/b) dengan ketelitian 69,70476%. Data hasil percobaan juga menunjukkan bahwa kenaikan massa sampel akan mengakibatkan kenaikan nilai absorbansi.Berdasarkan literatur, kandungan lisin dalam kentang adalah 190 mg dari 150 gram atau 0,1267% (b/b) kentang utuh tanpa pemasakan dan 283 mg dari 202 gram atau 0,1401% (b/b) kentang bakar (Scutero 2005).
Ketidakcocokan data percobaan dengan literatur menunjukkan bahwa masih terdapat kesalahan yang terjadi pada percobaan, antara lain kentang sudah tidak segar sehingga terjadi denaturasi protein dan asam aminonya, kesalahan paralaks dalam pembuatan masing-masing larutan, tidak melakukan pengukuran blangko di setiap selang pengukuran absorbansi larutan standar dan sampel, larutan sampel asam amino lisin sudah tidak murni lagi, dan kuvet yang digunakan kurang bersih.
Kesimpulan
Spektrofotometri memiliki banyak kegunaan aplikasi. Salah satu dari aplikasi ini adalah penentuan konsentrasi suatu zat. Kurva standar diperlukan untuk menentukan konsentrasi dari larutan sampel yang absorbansinya telah diketahui. Persamaan kurva standar yang dihasilkan adalah = 0,007x - 0,037 dengan R2 = 0,975. Konsentrasi asam amino lisin pada kentang dari hasil percobaan adalah (0,00043 ± 0,00013)% (b/b) dengan ketelitian 69,7674%. Masih terdapat kesalahan yang mungkin dilakukan pada percobaan ini.
Daftar Pustaka
Harvey David. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill Comp.
Rouessac Francis, Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques. Second Edition. West Sussex: John Wiley & Sons, Ltd.
Scutero James. 2005. Agricultural Handbook. Washington D.C.: U.S. Department of Agriculture.
Wang Joseph. 2001. Analytical Electrochemistry. Second Edition. New York: John Wiley & Sons, Inc.
0 comments: