Elektroforesis Kertas

Pendahuluan
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey 2000). Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik 2004). Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik (Rouessac 2007). Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Skoog 2002).
Teknik elektroforesis zona dibedakan berdasarkan medium penyangga, diantaranya elektroforesis kertas dan elektroforesis kertas selulosa asetat. Sesuai dengan perkembangan ilmu bahan, elektroforesis kertas menjadi fasa pertama dari perkembangan elektroforesis zona. Dengan menggunakan medium kertas, pemisahan dan analisis terhadap asam amino, peptida, nukleotida, dan ion-ion logam yang kecil dapat dilakukan. Kelemahan elektroforesis kertas yaitu adanya gangguan yang disebabkan oleh adanya gugus OH- yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah (Harjadi 1993). Kelemahan ini dapat diatasi dengan cara asetilasi gugus hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat yang tidak polar. Hal ini menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu, resolusi lebih baik, dan proses pemisahan berlangsung lebih cepat. Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah proses migrasi lebih cepat, pemisahan spot menjadi lebih kecil, mudah memisahkan sampel dengan spektrofotometri, dan mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit. Pada elektroforesis kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkan dengan cara kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya dan spotnya lebih kecil daripada cara basah. Oleh karena itu, percobaan ini menggunakan medium selulosa asetat.

Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan menunjukkan bagaimana komponen dalam senyawaan campuran dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis, menunjukkan bahwa beberapa indikator dan beberapa pigmen pada tinta adalah molekul yang dapat terionisasi, dan menunjukkan keuntungan elektroforesis menggunakan kertas selulosa asetat.

Alat dan Bahan
Alat-alat yang dipakai adalah alat elektroforesis 200 volt DC (30 menit) dan 150 volt DC (90 menit). Bahan-bahan yang digunakan adalah kertas selulosa asetat, bufer amonia dan amonium asetat atau bufer asam asetat dan amonium asetat, tinta warna hitam, indikator congo red, fenol red, brom fenol blue, dan campuran ketiganya, zat warna fluorecein, tartrazine, dan campuran keduanya, dan pewarna makanan sintetik sunset yellow dan poncean.

Prosedur Percobaan
Kertas elektroforesis atau kertas selulosa asetat dipotong dengan ukuran 30 x 10 cm sebanyak 3 buah untuk tinta dan pewarna makanan, indikator, dan zat warna. Kertas diberi garis vertikal di bagian tengah kertas sebagai tanda garis start. Spot dibuat dengan baik. Kertas kemudian dimasukkan ke dalam larutan bufer dan ditempatkan ke dalam alat elektroforesis, dirunning dengan potensial 200 v dan 150 v selama 30 menit dan 90 menit. Pemisahan yang terjadi diamatai dengan interval 5 – 10 menit. Pemisahan dan warna yang teramati dicatat. Setelah 30 menit dan 90 menit, arus dimatikan dan kertas diangkat dari alat tersebut. Bukti kertas hasil pemisahan disimpan untuk dokumentasi dan dicetak untuk bahan laporan.
 
Data Hasil Pengamatan
Elektroforesis kertas selulosa asetat pada tinta dan pewarna makanan
Gambar 1. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada tinta dan pewarna makanan sebelum dirunning

Gambar 2. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada tinta dan pewarna makanan sesudah dirunning






A : tinta hitam
B : sunset yellow
C : poncean

Elektroforesis kertas selulosa asetat pada zat warna (1)
Gambar 3. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada zat warna (1) sebelum dirunning

Gambar 4. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada zat warna (1) sesudah dirunning






A : fluorecein
B : tartrazine
C : campuran keduanya



Elektroforesis kertas selulosa asetat pada indikator

Gambar 5. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada indikator sebelum dirunning

Gambar 6. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada indikator sesudah dirunning






A : fenol red
B : bromfenol blue
C : congo red

Elektroforesis kertas selulosa asetat pada zat warna (2)

Gambar 7. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada zat warna (2) sebelum dirunning

Gambar 8. Hasil elektroforesis kertas selulosa asetat pada zat warna (2) sesudah dirunning







A : fluorecein
B : campuran keduanya
C : tartrazine

 
Pembahasan
Percobaan dilakukan untuk mengetahui muatan komponen pada sampel dan mengetahui komponen penyusun campuran sampel. Sampel yang diuji yaitu tinta dan pewarna makanan, zat pewarna, dan indikator. Analisis elektroforesis ini dapat menunjukkan migrasi dari sampel-sampel tersebut. Arah migrasi yang terjadi ditentukan oleh muatan dari sampel itu sendiri. Bila sampel bermuatan positif, maka sampel tersebut bermigrasi ke arah kutub negatif, begitu juga sebaliknya. Komponen penyusun campuran sampel juga dapat diketahui dengan menggunakan analisis elektroforesis. Suatu campuran sampel dikatakan mengandung sampel-sampel lain yang digunakan sebagai kontrol apabila jarak dan arah migrasinya sama. Jarak migrasi menentukan potensial kimia dan berat molekul yang dimiliki oleh sampel.
Pada percobaan, spot dibuat dengan ukuran sekecil mungkin dan tebal (bold pin point). Hal ini berkaitan dengan kepekatan dan berat spot. Spot yang besar akan menyebabkan jejak migrasi meluber. Pada alat elektroforesis, kutub negatif ditandai dengan kabel berwarna hitam dan kutub positif ditandai dengan kabel berwarna merah. Hasil percobaan menunjukkan bahwa seluruh sampel dan campuran sampel bermigrasi ke arah kutub negatif. Hal ini berarti bahwa seluruh sampel dan campuran sampel memiliki muatan positif. Bufer amonium asetat yang digunakan dalam percobaan ini berfungsi sebagai jembatan konduksi di antara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik. Media berupa kertas selulosa asetat digunakan sebagai reseptor spot dari sampel dan menyediakan jalur migrasi komponen sampel.
Hasil percobaan pada tinta dan pewarna makanan menunjukkan bahwa laju migrasi pewarna makanan “poncean” lebih besar daripada pewarna makanan “sunset yellow” dan tinta hitam karena jarak migrasi pewarna makanan “poncean” paling besar. Pada spot tinta hitam yang bermigrasi terbentuk gradasi warna. Hal ini disebabkan oleh proses pengeringan tinta hitam yang kurang lama sehingga masih ada bagian spot tinta hitam yang masih basah. Hasil percobaan pada zat warna (1) menunjukkan bahwa laju migrasi sampel tartrazine lebih besar daripada laju migrasi sampel fluorecein. Selain itu, jarak migrasi sampel tartrazine memiliki kesamaan dengan jarak migrasi campuran. Hal ini berarti bahwa dalam sampuran tersebut mengandung komponen sampel tartrazine.
Hasil percobaan pada indikator menunjukkan bahwa indikator bromfenol blue memiliki laju migrasi yang paling tinggi dibandingkan dengan indikator fenol red dan indikator congo red. Hal ini disebabkan oleh jarak migrasi komponen indikator brom fenol blue paling besar diantara indikator-indikator tersebut. Pada congo red hanya terdapat sedikit jejak migrasi dari komponennya. Hasil percobaan pada zat warna (2) juga menunjukkan hasil yang sama seperti hasil percobaan pada zat warna (1). Zat warna tartrazine memiliki laju migrasi yang lebih tinggi daripada zat warna fluorecein karena jarak migrasi komponen zat warna tartrazine lebih besar daripada komponen zat warna fluorecein. Jarak migrasi komponen zat warna tartrazine juga memiliki kesamaan dengan jarak migrasi campuran zat warna yang berarti bahwa campuran tersebut mengandung komponen zat warna tartrazine.

Simpulan
Elektroforesis kertas selulosa asetat digunakan untuk identifikasi muatan suatu sampel dan komponen dalam suatu campuran sampel. Seluruh sampel dan campuran sampel yang diuji bermuatan positif. Pewarna makanan “poncean” memiliki laju migrasi yang paling tinggi dibandingkan tinta hitam dan pewarna makanan “sunset yellow”. Zat warna tartrazine memiliki laju migrasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan fluorecein. Campuran zat warna mengandung komponen zat warna tartrazine. Indikator bromfenol blue memiliki laju migrasi paling tinggi dibandingkan dengan fenol red dan congo red.

Daftar Pustaka
Harjadi W. 1993. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill Comp.
Patnaik Pradyot. 2004. Dean’s Analytical Chemistry Handbook. Second Edition. New York: McGraw-Hill Comp.
Rouessac Francis, Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques. Second Edition. West Sussex: John Wiley & Sons, Ltd.
Skoog Douglas et al. 2002. Fundamentals of Analytical Chemistry. Eight Edition. Canada: Thomson Learning.
Read More

Spektrofotometri


Pendahuluan
Spektrofotometri merupakan bagian dari sperktroskopi, yaitu ilmu yang mempelajari interaksi radiasi dengan materi. Spektrofotmetri sendiri adalah istilah yang lebih terbatas, merupakan pengukuran kuantitatif dari intensitas radiasi elektromagnetik pada satu atau lebih panjang gelombang dengan suatu transduser (detektor) (Harvey 2000). Metode spektrofotometri menghasilkan sebuah tampilan hubungan antara intensitas radiasi yang teremisikan, terabsorpsi, atau terhamburkan oleh sampel dan kuantitas yang berhubungan dengan energi foton (E), seperti konsentrasi dan panjang gelombang (λ), yang disebut dengan spektrum (Wang 2001).
Pada percobaan ini, metode spektrofotometri diterapkan pada penentuan konsentrasi asam amino lisin pada kentang. Panjang gelombang maksimum (λ max) untuk percobaan ini telah ditentukan, yaitu 625 nm, dimana pada panjang gelombang ini respon absorbans berada dalam kondisi maksimum sehingga akan memiliki sensitivitas yang baik dan limit deteksi yang rendah. Hal ini juga dapat mereduksi kesalahan dalam pengukuran (Rouessac 2007).
Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan mengetahui spektrum serapan suatu zat dan menentukan kandungan asam amino bebas pada kentang dengan cara spektrofotometri.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang dipakai adalah spektrofotometer, kuvet, labu takar 25 ml dan 50 ml, tabung reaksi, penangas air, sentrifusa, spektronik-20, gelas piala, dan buret 50 ml. Bahan-bahan yang digunakan adalah salah satu larutan standar pada penentuan kadar asam amino bebas, kentang, piridin 10%, ninhidrin 2%, asam amino lisin (20-50 ppm), dan kapas.
Prosedur Percobaan
· Pembuatan larutan standar dan blanko
Larutan standar disiapkan dengan menggunakan analat asam amino lisin, dengan konsentrasi 20 ppm sampai 50 ppm. (dibuat dengan menggunakan labu takar 25 atau 50 ml dari larutan stok). 5 ml larutan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 0,5 ml piridin 10% dan 0,5 ml ninhidrin 2%. Tabung ditutup dengan kapas kemudian ditempatkan dalam penangas air mendidih selama 20 menit atau sampai terjadi perubahan warna. Setelah dingin diencerkan menjadi 50 ml dalam labu takar dan ditera.Larutan blanko disiapkan dengan mengganti analat menggunakan air suling.
· Pembuatan larutan contoh
Disuspensikan 0,5 gram kentang dalam 20 ml air kemudian disentrifuse, supernatan ditampung dalam labu takar 50 ml. Proses tersebut diulangi, kemudian tepatkan volume supernatan sampai tanda tera dengan air suling. Ektrak asam amino 5 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambah 0,5 ml piridin 10% dan 0,5 ml ninhidrin 2%. Tabung ditutp dengan kapas kemudian ditempatkan dalam penangas air mendidih selama 20 menit atau sampai terjadi perubahan warna. Setelah dingin diencerkan menjadi 50 nl dalam labu takar.
· Analisis menggunakan spektrofotometer
Larutan standar, blanko, dan larutan contoh yang telah dibuat dianalisis menggunakan spektrofotometer. Digunakan panjang gelombang maksimum 625 nm (penentuan panjang gelombang maksimum ini tidak ditentukan dalam percobaan kali ini).
Data Hasil Pengamatan
· Analisis Larutan Standar
Tabel hasil pengamatan larutan standar
Konsentrasi
Transmitan
Absorbansi
20 ppm
78,6%
0,1046
30 ppm
68,6%
0,1637
40 ppm
54,2%
0,2660
50 ppm
49,4%
0,3063
Rata-rata
0,2101
St. Deviasi
0,0925
Panjang gelombang = 625 nm
Gambar hasil pengamatan larutan standar
DSC05029.JPG
DSC05033.JPG DSC05031.JPG DSC05028.JPG

20 ppm 30 ppm 40 ppm 50 ppm
· Analisis Larutan Blangko
Gambar hasil pengamatan larutan blangko
DSC05034.JPG

· Analisis Larutan Sampel
Tabel hasil pengamatan larutan sampel
Ulangan
Massa Sampel (gram)
Transmitan
Absorbansi
Konsentrasi
ppm
% b/b
1
0,5009
60,2%
0,2204
2,6771
0,0026
2
0,5033
51,6%
0,2873
3,6329
0,0036
3
0,5090
39,6%
0,4023
5,2757
0,0052
4
0,5150
38,2%
0,4179
5,4986
0,0054
Rata-rata
0,0042
St. Deviasi
0,0013
Panjang gelombang = 625 nm
Contoh Perhitungan Konsentrasi Sampel (menggunakan data ulangan ke-2):
Absorbansi= 0,2873= y
Didapatkan persamaan kurva standar y = 0,007x – 0,037 dengan R2 = 0,975
Untuk y= 0,2873 maka
0,2873 = 0,007x - 0,037
0,2873 – 0,037 = 0,007x
x = 35,7571 ppm (konsentrasi sampel dalam ppm)
Konsentrasi (ppm) = berat (mg) zat terlarut per berat (kg) pelarut
Maka berat (kg) pelarut =
= = 14,0755 kg
= 14075,5 gram
Berat Larutan = Berat sampel + Berat Pelarut
= 0,5033 gram + 14075,5 gram = 14076,0033 gram
Konsentrasi sampel (% b/b) =
=
= 0,0036%
Rata-rata =
= = 0,0042%
Sd =
=
= 0,0013
Ketelitian =
=


Pembahasan
Aplikasi spektrofotometri berguna dalam penentuan konsentrasi suatu kandungan zat. Percobaan ini menggunakan metode spektrofotometri untuk menentukan kandungan asam amino lisin pada kentang. Hal yang pertama kali harus dilakukan adalah menentukan spektrum absorpsi lisin sehingga puncak spektrum gelombang tersebut (panjang gelombang maksimum) dapat diketahui. Namun dalam percobaan ini tidak dilakukan karena keterbatasan waktu. Panjang gelombang maksimum yang dipakai merupakan data sekunder, yaitu 625 nm.
Setelah panjang gelombang maksimum diketahui, maka dilakukan pengukuran absorbansi dari larutan standar lisin dengan konsentrasi 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, dan 50 ppm. Dari percobaan ini dihasilkan kurva standar dengan persamaan y = 0,007x - 0,037 dengan R2 = 0,975. Konsentrasi dalam kurva standar berupa ppm bukan % b/b karena tidak diketahui nilai dari berat pelarut. Semakin tinggi konsentrasi lisin, nilai transmitan akan semakin rendah dan nilai absorbansi akan semakin tinggi. Hal ini disebabkan oleh jumlah partikel zat terlarut (lisin) meningkat seiring dengan meningkatnya konsentrasi sehingga berkas sinar yang diserap akan semakin tinggi (absorbansi tinggi) dan sinar yang diteruskan akan semakin rendah (transmitan rendah). Percobaan ini tidak menggunakan larutan standar protein seperti Bovin Serum Albumin (BSA) karena hanya dilakukan pengukuran absorbansi oleh satu jenis asam amino spesifik, bukan oleh protein yang merupakan polimer dari asam amino.
Perlakuan yang sama juga dilakukan pada air suling yang telah ditambahkan 0,5 ml piridin 10% dan 0,5 ml nihidrin 2%. Fungsi dari larutan ini adalah sebagai blangko. Blangko adalah larutan yang mendapatkan perlakuan yang sama dengan sampel dan standar namun tidak mengandung analat. Tujuan pengukuran absorbansi blangko adalah mengetahui besarnya serapan oleh zat bukan analat. Biasanya, absorbansi blangko dibuat nol (Wang 2001).
Berlanjut pada sampel berupa kentang, dilakukan pengukuran absorbansi dari larutan sampel kentang. Ninhidrin digunakan pada kentang untuk membentuk kompleks berwarna ungu jika bereaksi dengan asam amino. Dari absorbansi yang didapatkan, dicari konsentrasi (ppm) dari larutan sampel tersebut menggunakan persamaan kurva standar. Kemudian dari konsentrasi (ppm) dicari bobot pelarutnya dalam kg. Setelah dikonversi menjadi satuan gram, dicari bobot total larutan dengan penambahan bobot pelarut dengan bobot zat terlarut (bobot sampel). Konsentrasi (% b/b) kemudian didapat dengan membagi bobot zat terlarut (bobot sampel) dengan bobot total larutan. Konsentrasi (% b/b) lisin pada kentang dari percobaan adalah (0,0042 ± 0,0013)% (b/b) dengan ketelitian 69,70476%. Data hasil percobaan juga menunjukkan bahwa kenaikan massa sampel akan mengakibatkan kenaikan nilai absorbansi.Berdasarkan literatur, kandungan lisin dalam kentang adalah 190 mg dari 150 gram atau 0,1267% (b/b) kentang utuh tanpa pemasakan dan 283 mg dari 202 gram atau 0,1401% (b/b) kentang bakar (Scutero 2005).
Ketidakcocokan data percobaan dengan literatur menunjukkan bahwa masih terdapat kesalahan yang terjadi pada percobaan, antara lain kentang sudah tidak segar sehingga terjadi denaturasi protein dan asam aminonya, kesalahan paralaks dalam pembuatan masing-masing larutan, tidak melakukan pengukuran blangko di setiap selang pengukuran absorbansi larutan standar dan sampel, larutan sampel asam amino lisin sudah tidak murni lagi, dan kuvet yang digunakan kurang bersih.
Kesimpulan
Spektrofotometri memiliki banyak kegunaan aplikasi. Salah satu dari aplikasi ini adalah penentuan konsentrasi suatu zat. Kurva standar diperlukan untuk menentukan konsentrasi dari larutan sampel yang absorbansinya telah diketahui. Persamaan kurva standar yang dihasilkan adalah = 0,007x - 0,037 dengan R2 = 0,975. Konsentrasi asam amino lisin pada kentang dari hasil percobaan adalah (0,00043 ± 0,00013)% (b/b) dengan ketelitian 69,7674%. Masih terdapat kesalahan yang mungkin dilakukan pada percobaan ini.
Daftar Pustaka
Harvey David. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill Comp.
Rouessac Francis, Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques. Second Edition. West Sussex: John Wiley & Sons, Ltd.
Scutero James. 2005. Agricultural Handbook. Washington D.C.: U.S. Department of Agriculture.
Wang Joseph. 2001. Analytical Electrochemistry. Second Edition. New York: John Wiley & Sons, Inc.
Read More
Subscribe to: Posts (Atom)